ヒトiPS細胞・ES細胞から作製した視神経細胞を用いて薬物効果を判定する技術を世界で初めて開発
視神経疾患に対する治療薬を新たに開発する（創薬）ことが可能に
国立成育医療研究センター 病院 眼科医長・研究所 視覚科学研究室長の東 範行の研究チームは、これまでに、ヒトiPS 細胞から機能する神経線維（軸索）をもつ視神経細胞（網膜神経節細胞）を作製することに、世界で初めて成功しました。これにより、重篤な視覚障害を起こす視神経疾患の原因や病態の解明、診断・治療の研究に大きな道が開けました。これに引き続き、今回はヒトES細胞からもiPS細胞と同様の視神経細胞（網膜神経節細胞）を作製することに成功するとともに、これらの視神経細胞を用いて、薬物の効果を判定する技術を開発しました。これによって、視神経疾患に対する治療薬を新たに開発する（創薬）ことが可能となりました。
プレスリリースのポイント
- 眼から脳へ視覚情報を伝達する視神経は、網膜に細胞体（網膜神経節細胞）があり、そこから長い神経線維（軸索）が伸びて、視神経管を通って脳に達する。これまでにヒトの視神経細胞を純粋に培養することはできず、動物から単離培養しても、神経線維（軸索）を温存することは不可能でした。当研究チームは、一昨年にヒトiPS細胞から、昨年にマウスiPS細胞およびES細胞から、培養皿の中で機能する軸索をもつ視神経細胞（網膜神経節細胞）を作製することに、世界で初めて成功しました。これによって、重篤な視力障害を起こすさまざまな視神経疾患に対して、疾患の原因解明、新規診断法の開発、再生医療、創薬など、新たな医療に関する研究を、ヒト細胞を用いて培養皿の中で行えるようになりました。
- 今回、ヒトES細胞からも同様に、視神経細胞（網膜神経節細胞）を作製することに世界で初めて成功しました。これにより、この視神経細胞の作製法が、多能性幹細胞の種類を超えて、普遍的な技術であることが確認されました。ヒト iPS細胞およびES細胞から作製した視神経細胞を用いて、神経栄養因子や神経抑制因子の効果を培養皿の中で判定する技術を、世界で初めて開発しました。これまでの薬物研究では、ヒト細胞は中枢神経なので採取できず、マウス等の動物の細胞を用いてきました。しかし、動物の薬物に対する生体を用いて行われてきましたが、薬物に対する反応がしばしばヒトとは違うため、ヒトに有効な薬物の開発（創薬）が円滑にできませんでした。
- 今回の研究成果によって、ヒト細胞を用いて神経系の薬物評価ができるようになり、創薬への道のりが大きく短縮されると思われます。ことに、患者の細胞由来のiPS細胞を用いれば（疾患iPS細胞）、疾患の特徴をもつ視神経細胞モデルを作製することができ、これに対して効果のある薬剤を開発することもできます。失明につながる視神経疾患に対して、新たな薬物を開発する道が大きく開けました。
研究の背景
視神経は、眼と脳をつないで、眼の網膜に映った視覚情報を脳へ伝達しています。網膜では視覚情報が、受容器である視細胞からさまざまに修飾され、その後に網膜神経節細胞の長い軸索によって、視神経を通って脳へ到達します（図１）。したがって、視神経は、網膜にある細胞体（網膜神経節細胞）から伸びる長い神経線維（軸索）によって構成されています。
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視神経が障害されれば、重篤な視力障害が起こります。その原因として、視神経炎や遺伝性視神経障害、虚血、外傷などさまざまな疾患がありますが、なかでも緑内障は40歳以上の日本人の5％が罹患し、治療中の患者数約30万人（厚生省患者調査2002年）、潜在患者数は400万人と非常に多く、我が国の失明原因の第1位（約25%）を占めています。
作製された神経細胞は、1-2cmにも及ぶ長さの神経線維（軸索）をもっていました。そして、視神経細胞（網膜神経節細胞）に特有な構造や蛋白がすべて存在していることが、免疫染色、電子顕微鏡観察、分子生物学的方法によって証明されました（図２）。
いろいろな視神経疾患の病態解明や薬剤効果の判定には、これまで動物モデル（in vivo実験）が使われてきました。一方、培養皿でのin vitro実験では、動物の網膜から視神経細胞（網膜神経節細胞）が単離培養されて用いられていますが、採取して培養皿で生存可能な動物の視神経細胞（網膜神経節細胞）は未熟ものに限られ、さらに神経線維（軸索）が千切れてしまっており殆どありません。視神経は中枢神経なので、ヒトでは採取することが不可能です。
視神経疾患では、神経線維（軸索）が主に障害されるので、培養皿でのin vitro実験による病態研究や創薬の研究は、これまで十分に行われてきませんでした。ことに、薬物効果はヒトと動物ではしばしば異なるため、ヒト細胞を使用できない事は、創薬研究の大きな障害となっていました。
再生医療の分野では、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞の研究が進められています。ES細胞やiPS細胞から網膜やその一部分である視細胞を作る研究は行われてきましたが、培養皿の中で長い軸索をもつ視神経細胞（網膜神経節細胞）を作ることは、非常に難しいと考えられてきました。視神経は軸索で構成されており、そこに病気が起こるので、視神経疾患の研究においては、長い軸索をもつ網膜神経節細胞を得ることが、どうしても必要でした。
国立成育医療研究センター 病院 眼科医長・研究所 視覚科学研究室長の東 範行の研究チームは、これまでに、ヒトiPS 細胞やマウスのiPS細胞およびES細胞から視神経細胞（網膜神経節細胞）を、培養皿の中で作製することに世界で初めて成功しました。これは、皮膚由来のiPS細胞やES細胞を培養し、外から形態形成遺伝子などを導入することなく、培養条件のみによって、自動的にiPS細胞やES細胞から網膜神経節細胞に分化させることができる、画期的な細胞技術です。
このヒトiPS 細胞由来の神経細胞（網膜神経節細胞）の作製技術は、視神経を障害する疾患の病態解明や診断技術の研究、治療のための創薬、視神経の移植や再生医療などの臨床研究、視神経の発生、神経線維成長における経路探索のメカニズム、視覚成立の分子メカニズムなど、視覚生理学、神経学の基礎研究に大きく貢献すると考えられます。
研究の概要
今回、同研究チームは、同じ技術を用いて、ヒトES細胞からも同様に、視神経細胞（網膜神経節細胞）を作製することに成功しました。作製された神経細胞は、1-2cmにも及ぶ長さの神経線維（軸索）をもっていました。そして、視神経細胞（網膜神経節細胞）に特有な構造や蛋白がすべて存在していることが、免疫染色、電子顕微鏡観察、分子生物学的方法によって証明されました（図２）。
神経としての機能については、神経線維（軸索）に軸索流（軸索の中のミトコンドリアなどの物質の流れ）が みられ、神経情報伝達の電気生理反応（活動電位、活動電流）があることが証明されました（図３、担当：埼玉医科大学医学部生理学 渡辺修一教授､田丸文信助教）。作られた視神経細胞（網膜神経節細胞）は、構造・機能ともに十分に成熟したものでありました。
これにより、この視神経細胞の作製法が、動物種や多能性幹細胞の種類を超えて、普遍的な技術であることが確認されました。
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次に、これらのヒトiPS細胞およびES細胞から視神経細胞（網膜神経節細胞）を用いて、さまざまな薬物の効果を判定する技術を開発しました。神経の成長を亢進する神経栄養因子や成長を妨げる抑制因子を投与すると、視神経細胞の発生や神経線維（軸索）に大きな変化がみられ、その変化は投与した化合物の濃度と相関していました（図４、図５）。
したがって、薬物の効果を定量的に検討することが可能になりました。iPS細胞およびES細胞いずれから作製した視神経細胞（網膜神経節細胞）も同等の結果が得られ、どちらを使っても有効な薬物評価ができることがわかりました。
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次に、視神経細胞の誘導物質の効果を判定する技術を開発しました。視神経線維（軸索）は、眼の網膜から脳の中へ複雑な道のりを経て伸びています（図１）。発生期におけるこの道のりを経路探索（pathfinding）といい、各道程で方向を誘導する物質が働いています。自分の方へ導く物質と自分の方へ来させない物質があり、これらは組み合わさって誘導しています。
これらの効果を判定する方法を、局所的な誘導物質投与、動画等で評価する方法を開発しました（図５）。誘導物質の評価は、再生医療で視神経細胞を移植する場合、視神経線維（軸索）を正しい道のりに導くために重要な技術です。
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本研究の成果は、Scientific Reports 誌に12月1日、英国時間10:00 am（日本時間 11月30日19:00 pm）にオンライン（電子版）で発表されます。
これを用いて、今後さまざまな方向に応用できることが期待されます。まず、視神経を障害する疾患の病態解明や診断技術の研究に大きく貢献すると考えられます。iPS細胞およびES細胞から作製された視神経細胞はほぼ同等の品質でしたが、iPS細胞では遺伝性疾患などの研究ができます。患者由来（皮膚や血液）の細胞をiPS細胞化し、そこからこの視神経細胞（網膜神経節細胞）を作製すれば、疾患の固有因子をもつ疾患iPS細胞になります。あるいは、iPS細胞およびES細胞いずれからも作製された視神経細胞に対して、低酸素や加圧などのストレスを加えると、虚血性視神経症や緑内障などの疾患細胞モデルになります。これを解析すれば、疾患の原因や発生過程、病態の分子メカニズムを解明することができます。ここから、患者ごとの診断技術が開発されることでしょう。
今後の展望
この細胞作製技術によって、我々は初めて、機能がある神経線維（軸索）をもつヒト視神経の培養細胞を手に入れることができました。ヒト視神経細胞は中枢神経であるので採取することができず、これまで培養系in vitroでの実験を行うことができませんでしたが、これが可能となりました。これを用いて、今後さまざまな方向に応用できることが期待されます。まず、視神経を障害する疾患の病態解明や診断技術の研究に大きく貢献すると考えられます。iPS細胞およびES細胞から作製された視神経細胞はほぼ同等の品質でしたが、iPS細胞では遺伝性疾患などの研究ができます。患者由来（皮膚や血液）の細胞をiPS細胞化し、そこからこの視神経細胞（網膜神経節細胞）を作製すれば、疾患の固有因子をもつ疾患iPS細胞になります。あるいは、iPS細胞およびES細胞いずれからも作製された視神経細胞に対して、低酸素や加圧などのストレスを加えると、虚血性視神経症や緑内障などの疾患細胞モデルになります。これを解析すれば、疾患の原因や発生過程、病態の分子メカニズムを解明することができます。ここから、患者ごとの診断技術が開発されることでしょう。
治療の研究にも大きく貢献するでしょう。さまざまな治療薬の効果を、時間や濃度など条件を変えて検討することができます。神経線維（軸索）が障害され死滅することを予防、抑制する神経保護薬、あるいは神経線維（軸索）の再生・可塑性を促す神経再生薬の開発など、視神経疾患を治療するための創薬にもつながります。
これまで、視神経の移植や再生医療の研究はほとんど進んでいませんでした。視神経は経路が長く、投射も複雑なので、移植しても視覚を復元させることは困難と思われるからです。しかし、再生医療の移植技術は日進月歩であり、この視神経細胞（網膜神経節細胞）を移植して神経線維（軸索）が脳に到達し、視覚が復元する日が来ると思われます。その点で、マウスで移植可能な視神経細胞（網膜神経節細胞）を得ることができるのは、再生医療の研究を大きく進歩させることでしょう。
今回、ヒト培養細胞を用いて、薬物の効果を正確に評価する方法を開発したことは、今後の神経保護薬あるいは神経再生薬の開発に大きな発展をもたらすでしょう。これまでの薬物開発は、まずマウス等の小型動物、ウサギやサル等の大型動物で効果と安全性を確認してから、ヒトでの検討が行われていました。しかし、動物とヒトでは薬物に対する反応が異なることがあるので問題になっており、ヒト細胞を用いて検討できるようになったことは大きな進歩です。
今回の薬物の効果と安全性を評価する技術は、正確であるとともに、効率もきわめて高いものです。ヒトiPS細胞からもES細胞からの視神経細胞の作製効率は90%以上であり、1か月以上も生存が可能です。
したがって、培養皿を並べて、さまざまな薬物を濃度を変え、時には複数を併用して、経時的に変化をみることができます。分子生物学的解析によって薬物動態や安全性の研究も可能です。
薬物を開発する最初の段階では、候補となる膨大な数の化合物をスクリーニングする必要があります。これらから、効率良く候補を選ぶこともできるでしょう。
したがって、培養皿を並べて、さまざまな薬物を濃度を変え、時には複数を併用して、経時的に変化をみることができます。分子生物学的解析によって薬物動態や安全性の研究も可能です。
薬物を開発する最初の段階では、候補となる膨大な数の化合物をスクリーニングする必要があります。これらから、効率良く候補を選ぶこともできるでしょう。
そして、未来の医療である再生医療にも貢献できます。視神経細胞を移植した場合、その神経線維（軸索）は、眼の網膜から脳の中まで、複雑な経路をたどらなければなりません。発生期に各道程では、方向を指示する誘導物質が働いていて方向を指示していますが、この誘導物質を有効に用いてなければ、移植した細胞が神経線維（軸索）は脳の適切な場所に到達することができません。この経路探索に有効な物質を検討して、視神経移植に貢献することができるでしょう。
以上のように、このヒト視神経細胞（網膜神経節細胞）の作製技術と薬物効果の評価技術は、今後の視神経疾患の診断から治療にわたる研究に大きく貢献することができます。失明の恐れがある重症視神経疾患の患者さんにとっても、大きな福音になることでしょう。
現在、ヒトiPS細胞およびES細胞から作製した視神経細胞を用いた疾患細胞モデルで、さまざまな薬物の効果と安全性の検討を進めています。また、これらの視神経細胞の動物への移植研究も行っており、その研究成果はまもなく発表できる予定です。
論文名および著者
- 論文名：In vitro assessment of the effect of neuroactive agents by use of retinal ganglion cells generated from human stem cells.
（和訳）ヒトの多能性幹細胞由来神経節細胞を用いた神経系薬物の培養系での評価 - 著 者：Tadashi Yokoi,1) Taku Tanaka,1) Emiko Matsuzaka,1) Fuminobu Tanalu,2) Shu-ichi Watanabe,2) Sachiko Nishina,1) Noriyuki Azuma1)
1) Department of Ophthalmology and Laboratory for Visual Science, National Center for Child Health and Development, Tokyo, Japan
2) Department of Physiology, Faculty of Medicine, Saitama Medical University - 掲載雑誌：Scientific Reports
用語解説
- 幹細胞（stem cell）
別の種類の細胞に分化（発生における特別な細胞への変化）する能力を持つとともに、自分と同じ 細胞が際限なく増殖できる細胞。生体内では、臓器の発生や組織の維持において、分化する細胞の源を供給する役割を担っている。人工的に作られ、さまざまな細胞に分化する能力を獲得した細胞は、人工多能性幹細胞と呼ばれ、ES細胞とiPS細胞が代表的である。 - ES 細胞
受精卵から発生を僅かに進めた初期胚から作製され、さまざまな細胞・組織に分化することができる人工多能性幹細胞。再生医療において、重要なソースである。ヒトES細胞は、ヒト生命の源を使って作るので、それを 用いた研究は、施設のみならず文部科学省の厳しい審査と制約のもとで行われる。 - iPS 細胞
皮膚や血液などの体細胞に4つの遺伝子（山中因子）を導入することによって作製される人工多能性幹細胞。ES細胞と同様、多能性幹細胞。さまざまな細胞・組織に分化することができ、再生医療において期待されるソースである。皮膚や血液など材料は比較的容易に手に入るだけでなく、体細胞から作られるのでES細胞のような倫理的制約が少ない。重要なことは、患者の細胞から作れば、疾患の素因をもつ疾患iPS細胞となり、疾患の分子メカニズムの解明や、有効な薬剤の開発を行えることである。疾患素因をもつES細胞を作ることは難しいので、これはiPS細胞の大きな利点である。 - 動物モデル（in vivo実験）
疾患が自然に発症する動物（多くは遺伝子変異をもつ）が発見されて解析されることもあるが、最近はヒトの疾患でみつかった遺伝子の働きを消す（ノックアウト）あるいは変異を導入する（ノックイン）動物が作られることが多い。大部分はマウスかラットである。これらは病態の研究に役立つものの、動物とヒトでは異なることが多く、とくに薬剤の効果が大きく異なる点が問題となる。ヒト細胞を用いた研究が必要である。 - 培養（in vitro）実験
薬剤の効果判定は、培養皿の中に細胞を撒いて、培養液内に薬剤を投与して行う。培養皿を並べれば、薬剤の種類、濃度を変えて検討し、経時的変化も観察できる。ヒト細胞の方が動物細胞に比べはるかに好ましいが、ヒトの皮膚や血液などは採取しやすいものの、神経細胞ことに中枢神経は採取できないので、使用することはできない。 - 神経細胞（ニューロン）と軸索
神経系の細胞は、１つがニューロンと呼ばれ、細胞の本体である細胞体と電気信号を伝達する線維（軸索）で構成されている。他に、隣接する細胞と情報伝達する短い樹状突起が存在する。神経が長い距離をわたって電気信号を伝達するためには、軸索が何より重要である。神経の多くの疾患は、細胞体だけでなく軸索が障害されて起こるので、疾患の研究に軸索の観察は欠かすことができない。
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- 視神経細胞（網膜神経節細胞）
視神経は、眼と脳をつないでおり、眼の網膜に映った視覚情報を脳へ伝達する。網膜では視覚情報が、受容器である視細胞で受け取られた後に、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞等の次の段階の細胞に伝達されてさまざまに修飾され、その後に網膜神経節細胞の細胞体に伝達される。その情報は、電気信号として、長い軸索によって、視神経内を通って脳へ到達する。視神経細胞は、脳の一部であり、中枢神経に属する。 - 自己分化
発生において初期の幹細胞が各臓器の特殊な細胞へ分化する時は、それぞれの分化を誘導する遺伝子（形態形成遺伝子）が、自動的に働く。これを自己分化と言う。眼の発生では、4000を超える形態形成遺伝子が働くと考えられている。人工多能性幹細胞から特殊な細胞へ分化を誘導する場合、その形態形成遺伝子を外から細胞内に入れて作ることは比較的容易であるが、培養条件によっては細胞内で遺伝子を自動的に働かせ自己分化させることが非常に難しい。再生医療などでは、余計な遺伝子を外から入れない方が好ましい。 - 細胞マーカー
各々の特殊な細胞に固有に働くあるいは存在する物質で、主に蛋白あるいはその設計図である蛋白。培養実験で、目的の細胞が出来ているかを確認する場合に調べられる。分化における形態形成遺伝子あるいは蛋白（形態形成因子）、あるいは細胞の機能や構造に固有の遺伝子、蛋白が用いられることが多い。 - 軸索流
神経線維（軸索）の中では、栄養因子などさまざまな物質が流れている。神経線維の機能として調べられることが多く、細胞の1か所に流れる物質を注入して、軸索全体に広がって行くかどうかで確認する。
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- 活動電位・活動電流
神経線維（軸索）が、電線のように、情報を電気信号によって伝達する過程で発生する電位と電流。電位差は軸索の細胞内外にあり、電流は細胞体から軸索終末の方向に流れる。細胞内に細い電極を刺して検出する。 - 視神経疾患（視神経症）
形成異常（先天異常）や遺伝素因による変性症の他に、感染、炎症、外傷などさまざまな原因で起こる。長い神経線維（軸索）が主に侵されやすい。したがって、神経疾患の研究には、軸索の評価が必須である。 - 緑内障
眼球の中を循環している房水の排水路が詰まり、眼内圧が上昇して、視神経細胞の軸索を圧迫され細胞死に至る視神経障害。加齢とともに増加し、40歳以上の約5％が罹患し、治療中の患者数約30万人、潜在患者数は400万人と非常に多く、我が国の失明原因の第1位（25%）を占めている。 - 疾患iPS細胞
患者の皮膚や血液などの細胞から作製したiPS細胞で、疾患の素因をもち、ことに遺伝疾患では原因遺伝子の変異をもつので、疾患の病態解明や治療薬の評価に役立つ。ただし、iPS細胞のままでは無意味で、目的の細胞に分化させる技術（視神経疾患の研究では視神経細胞に分化させる）があって、初めて研究ができる。 - 疾患細胞モデル
遺伝性疾患では、患者の細胞から作製したiPS細胞を用いれば、疾患の素因をもつ細胞モデルを作ることができる。しかし、虚血や緑内障（眼内圧の上昇による視神経圧迫）、外傷などでは、iPS細胞およびES細胞いずれから作製した視神経細胞であっても、低酸素や加圧等のストレスを加えることによって、疾患の細胞モデルにすることができる。 - 神経栄養因子
神経細胞の発生分化および神経線維（軸索）の伸長を促す物質。発生期には多くの神経栄養因子が働いていることが知られており、神経保護薬や神経再生薬の候補となっている。 - 神経抑制因子
神経栄養因子とは逆に、神経細胞の発生分化および神経線維（軸索）の伸長を妨げる物質。 - 神経保護
多くの視神経疾患は、神経線維（軸索）が傷害され、細胞全体が自己的に死滅する（アポトーシス）。この細胞死を予防あるいは、遅らせることを目的とする薬物治療。神経保護薬はさまざまな候補があるが、これまでヒト神経系細胞を培養して評価できる手段はなく、動物モデルや動物の培養細胞が用いられてきた。 - 神経再生
神経線維（軸索）がひとたび強く傷害され、細胞が自己的死滅する（アポトーシス）に至れば、再生は不可能である。しかし、神経線維（軸索）や細胞体の軽度損傷では、再生することができる。以前では中枢神経は再生しないと考えられていたが、現在は可能と考えられている。神経再生薬は、この再生を賦活する効果がある。神経再生薬の候補が幾つか挙げられているが、これまでヒト神経系細胞を培養して評価できる手段はなく、動物モデルや動物の培養細胞が用いられてきた。 - 再生医療
失われた組織を、多能性幹細胞を用いて復元する医療。ただし、ES細胞やiPS細胞を移植しただけでは再生は起こらず、まず目的とする細胞（視神経障害なら視神経細胞）にまず分化させ、それを移植する必要がある。 - 神経線維の経路探索（pathfinding）
神経線維（軸索）が伸びていく時、神経成長因子や抑制因子等のさまざまな物質がその経路を誘導していると考えられている。視神経の伸長経路は、中枢神経の中でも最も長く複雑である。この道程の各所では、方向を示す誘導物質が働いている。自分の方へ導く物質と来させない物質があり、これらが幾つも組み合わさって誘導を行っている。
- 本件に関する取材連絡先
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